Towards the long-term, conditional and tractable disruption of Notch3 signaling in zebrafish neural stem and progenitor cells
Vers une perturbation à long-terme, conditionnelle et traçable de la signalisation Notch3 dans les cellules souches et progéniteurs neuraux du poisson zébré
Résumé
Throughout the lifespan of most vertebrates, new neurons are continuously generated, playing a crucial role in the development and homeostasis of the nervous system. This neurogenesis is driven by neural stem and progenitor cells (NSPCs), which have the potential to divide, differentiate, or self-renew. In embryos, NSPCs are highly proliferative but gradually become quiescent, a state that is predominant in adult NSPCs. Extensive research demonstrated that Notch signaling is involved in the control of NSPC states and fates, however, the precise mechanisms by which it maintains NSPCs remain only partially understood. In Dr. Laure Bally-Cuif's laboratory, we investigate the molecular, cellular, and population-level principles that balance NSPCs maintenance and neurogenesis, using the zebrafish brain as our model system. My PhD research focused on the role of the Notch3 signaling pathway in NSPCs. The canonical Notch pathway is activated through interactions between a transmembrane Notch receptor and a ligand, both exposed on neighboring cells. This triggers cleavage of the intracellular domain of the receptor (NICD), which then translocates into the nucleus to activate target genes' transcription. Understanding Notch3 signaling is complicated by its diverse roles across different tissues and life stages, as well as its varying effects both at the plasma membrane and in the nucleus. Previous studies have shown that Notch3 is critical for maintaining NSPC progenitor status during development and promoting NSPC quiescence in adulthood. However, existing methods have not met the combined objectives of enabling conditional, long-term, and tractable Notch3 loss-of-function in NSPCs, nor have they effectively targeted only the nuclear functions of Notch3.To address this, I adapted the Ab-SPOP technique, which relies on a GFP tag fused to the protein of interest (POI). This tag is recognized by a modified nanobody that promotes in vivo ubiquitination and proteasomal degradation of the POI. Using CRISPR-Cas9, I generated an endogenous notch3-gfp fusion by inserting gfp at the extremity of the NICD coding region and validated the functionality of the Notch3-GFP fusion protein. This GFP tag enabled me to monitor Notch3 signaling dynamics in NSPCs and assess the feasibility of quantifying nuclear NICD-GFP as a proxy of the canonical Notch3 signaling activity.After preliminary validations of the functionality of the nanobody tool, I created a transgenic line conditionally expressing the modified nanobody and an expression marker in NSPCs under Cre-loxP recombination. I then crossed these transgenic fish with the notch3-gfp knock-in line. I confirmed the efficiency of NICD-GFP degradation in the nuclei of NSPCs in 6 days post-fertilization larvae. I also validated the inducibility of the transgene expression directly in adult fish and the formation of transgene-expressing cell clones in the telencephalon. Moreover, adult fish induced as embryos exhibited large transgene-expressing cell clones, including a few NSPCs and many differentiated cells.My work prepared the analysis of Notch3 functions and set up a method easily transposable to other proteins. To continue my project, I will quantify NICD-GFP in the nuclei of transgene-expressing adult NSPCs to validate the efficiency of the system in adult cells. Additionally, I have developed and conducted initial validations of notch3 shRNAs as an alternative method for medium-term and tractable knock-down -although not restricted to nuclear signaling-. Ultimately, I will use these new tools to induce Notch3 loss-of-function in NSPCs, and analyze the resulting phenotypes inside the clones and their neighboring cells.
Chez la plupart des vertébrés, de nouveaux neurones sont continuellement générés au cours de la vie, jouant un rôle essentiel dans le développement et l'homéostasie du système nerveux. Cette neurogénèse provient des cellules souches et progénitrices neurales (CSPNs), qui ont le potentiel de se diviser, et se différencier, ou s'auto-renouveler. Chez l'embryon, les CSPNs sont prolifératives et deviennent progressivement quiescentes, un état dominant des CSPNs adultes. La voie de signalisation Notch est impliquée dans la régulation des CSPNs, mais les mécanismes précis par lesquels il maintient les CSPNs ne sont encore que partiellement compris. Dans le laboratoire du Dr Laure Bally-Cuif, nous étudions les processus moléculaires, cellulaires et populationnels qui contribuent à l'équilibre entre le maintien des CSPNs et la neurogenèse, en utilisant le cerveau du poisson zébré comme système modèle. Mes recherches doctorales ont porté sur le rôle de la voie Notch3 dans les CSPNs. La voie canonique est activée par l'interaction entre un récepteur transmembranaire Notch et un ligand, les deux exposés sur des cellules voisines, déclenchant le clivage du domaine intracellulaire du récepteur (NICD), qui se déplace ensuite dans le noyau pour activer la transcription de gènes cibles. Etudier Notch3 est complexe en raison de ses multiples rôles dans plusieurs tissus et stades de la vie, ainsi que par ses activités à la fois à la membrane plasmique et dans le noyau. Des études ont montré que Notch3 est essentiel pour maintenir le statut de progéniteur des CSPNs au cours du développement, et pour promouvoir leur quiescence à l'âge adulte. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de combiner la perte de fonction conditionnelle de Notch3 à la possibilité d'une perte de fonction à long-terme, qui soit traçable dans les CSPNs, et ciblant efficacement uniquement les fonctions nucléaires de Notch3.Pour créer cette méthode, j'ai adapté la technique Ab-SPOP, qui utilise une étiquette GFP fusionnée à la protéine d'intérêt (POI), et un nanobody modifié qui reconnait GFP et promeut in vivo l'ubiquitination et la dégradation de la POI par le protéasome. Par CRISPR-Cas9, j'ai créé le gène notch3-gfp en insérant gfp à l'extrémité de la région codante du NICD endogène, puis j'ai validé la fonctionnalité de la protéine de fusion Notch3-GFP. Cette GFP m'a permis d'approcher la dynamique de la signalisation Notch3 dans les CSPNs, et de valider la faisabilité d'utiliser la quantité de NICD-GFP dans le noyau comme indicateur de l'activité de la signalisation Notch3.Après validation du nanobody, j'ai créé une lignée transgénique exprimant, de manière conditionnelle le nanobody modifié et un marqueur d'expression dans les CSPNs via Cre-loxP. J'ai ensuite croisé ces poissons transgéniques avec la lignée knock-in notch3-gfp. J'ai confirmé l'efficacité de la dégradation de NICD-GFP dans les noyaux de CSPNs sur des larves de 6 jours. J'ai validé l'expression du transgène, après induction chez le poisson adulte, et observé la formation de clones de cellules exprimant le transgène dans le télencéphale. De plus, les poissons adultes induits en tant qu'embryons présentaient de grands clones, comprenant quelques CSPNs et de nombreuses cellules différenciées. Mes travaux ont préparé l'analyse des fonctions de Notch3 et mis en place une méthode transposable à d'autres protéines. Dans la suite de mon projet, je quantifierai NICD-GFP dans les noyaux des CSPNs adultes exprimant le transgène afin de valider l'efficacité du système dans les cellules adultes. De plus, j'ai développé et effectué les premières validations de shRNAs ciblant notch3 comme méthode alternative (bien qu'efficace sur des échelles de temps moindres et ne ciblant pas spécifiquement les fonctions nucléaires de Notch3). Finalement, j'utiliserai ces outils pour étudier la perte de fonction de Notch3 dans les CSPNs, en analysant la composition des clones et leurs cellules voisines.
Origine | Version validée par le jury (STAR) |
---|